DNAシーケンシングの過程でPCRが使用される理由

DNAシーケンシングは、特定のDNAフラグメントのヌクレオチド配列を決定するために使用される手法です。サンガーシーケンシングと次世代シーケンシングは、2種類のシーケンシング方法です。蛍光マーカーは、配列内の各ヌクレオチドを識別するために使用されます。 PCRは、蛍光マーカーをDNAフラグメントに組み込むために使用されます。 PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）は、特定のDNAフラグメントの何百万ものコピーを生成するために実験室で使用される技術です。ゲル内のPCRフラグメントの分析により、DNAフラグメントのヌクレオチド配列を決定できます。

対象となる主要分野

1.シーケンスとは –定義、シーケンスの種類–次世代シーケンス、サンガーシーケンス 2.DNAシーケンシングの過程でPCRが使用される理由 –PCR中の蛍光色素の取り込み

重要な用語：ddNTP、dNTP、DNAシーケンス、蛍光色素、次世代シーケンス、PCR、サンガーシーケンス

シーケンシングとは

シーケンシングは、DNA分子のヌクレオチド配列を決定するために使用される実験技術です。サンガーシーケンシングと次世代シーケンシングは、DNAシーケンシングの2つの主要な方法です。両方のDNA配列決定法は、特定のDNA鎖のヌクレオチド配列を決定するためのPCRによるDNA鎖への蛍光マーカーの組み込みに関与しています。

サンガーシーケンシング

サンガーシーケンシングとして知られている最初のシーケンシング方法は、1975年にFredric Sangerによって最初に開発されました。その結果、サンガーシーケンシングとして知られています。サンガーシーケンシングは、in vitro DNA合成中のDNAポリメラーゼによる連鎖停止ジデオキシヌクレオチド（ddNTPS）の選択的取り込みに関与しています。そのため、チェーンターミネーション方式とも呼ばれます。通常のデオキシヌクレオチド（dNTP）は、DNA鎖の伸長に使用されます。連鎖成長を停止させるために、ddNTPも反応混合物に添加されます。 4種類のddNTPが4つの別々のPCR混合物に追加されます。したがって、ddATP、ddGTP、ddCTP、およびddTTPを追加することにより、4つの別々のPCR反応が実行されます。各反応混合物、単一タイプの追加されたddNTP（ddATPが追加された場合）について、異なるアンプリコンの成長はDNAフラグメントの各（A）ヌクレオチドで終了します。次に、4つの反応をゲル電気泳動で分離します。発光する蛍光は蛍光光度計で検出されます。サンガーシーケンシングは、DNAクローニングで使用されるフラグメントおよびPCRによって増幅されたフラグメントの配列を決定するために広く使用されています。サンガーシーケンシングの一般的な手順を図1に示します。

図1：サンガーシーケンシングの一般的なプロセス

次世代シーケンシング

次世代シーケンシングは、最新のDNAシーケンシングテクノロジーの総称です。次世代シーケンシングでは、チップ上でマイクロスケールで一度にいくつかのシーケンシング反応が実行されます。どちらのシーケンス方法でも、PCR中にアンプリコンに組み込まれる蛍光の標識ヌクレオチドを使用して、ヌクレオチド配列の決定を可能にします。蛍光マーカーの連鎖停止付加も次世代シーケンシングに関与しています。ただし、サンガーシーケンシングと次世代シーケンシングの主な違いは、次世代シーケンシングで異なるラベルのアンプリコンを分離するためにキャピラリー電気泳動を使用することです。キャピラリー電気泳動は、分子が電気泳動移動度に基づいて分離される分析分離法です。

DNAシーケンシングの過程でPCRが使用される理由

シーケンシング中に、ヌクレオチド配列を決定するために蛍光マーカーをDNA鎖に組み込む必要があります。この取り込みはPCR中に行われます。一般的に、4種類のdNTPは、PCR中に新たに合成されるDNA鎖に組み込まれます。この現象は、DNA配列決定で使用され、DNA配列を決定する際に、蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）をアンプリコンに組み込みます。

一般に、通常の4つの塩基（dNTP; dATP、dGTP、dCTP、dTTP）の混合物は、DNAシーケンシング中にPCR反応混合物に追加されます。

さらに、4つのジデオキシヌクレオチド（ddNTP、ddATP、ddGTP、ddCTP、およびddTTP）の1つが、PCR反応の成分として低濃度で添加されます。最後に、完全な配列を決定するために4つのPCR反応を実行する必要があります。

図1：決定されたDNA配列

NS ddNTPには3'-OH基がありません 入ってくるヌクレオチドがDNAポリメラーゼによって追加されます。したがって、ddNTPを組み込むと、連鎖成長が終了します。したがって、4つのPCR反応のそれぞれで、連鎖停止は特定の塩基で発生します。これらは ddNTPにはさまざまな蛍光色素も組み込まれています （NS ddATPは緑色の色素で標識されています。 NS ddGTPは黄色の染料で標識されています。 NS ddCTPは青でラベル付けされています、そしてその ddTTPは赤い染料でラベル付けされています). 蛍光色素の取り込みと連鎖停止は、PCR中に行われます。 アンプリコンはゲル上で実行され、ヌクレオチド配列の決定のために自動シーケンサーの蛍光光度計によってゲルの蛍光がスキャンされます。