サンガーシーケンシングとパイロシーケンシングの違いは何ですか

NS 主な違い サンガーシーケンシングとパイロシーケンシングの間はサンガーシーケンシングは、ジデオキシチェーンターミネーション法を使用するDNAシーケンシングアプローチですが、パイロシーケンシングは、合成によるシーケンシングの原理に基づくDNAシーケンシングアプローチです。したがって、サンガーシーケンシングでは、ヌクレオチドの識別は、全DNAフラグメントの増幅後のキャピラリー電気泳動によって行われますが、パイロシーケンスでは、ヌクレオチドの識別は、合成中のピロリン酸の放出によって行われます。

サンガーシーケンシングとパイロシーケンシングは、DNAシーケンシングの2つの方法です。前者はほとんどのターゲットの「ゴールドスタンダード」であり、後者は従来のサンガーシーケンシング法の最初の代替手段です。

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サンガーシーケンシングとは

サンガーシーケンシングは、1977年にFredric Sangerによって最初に開発されたDNAシーケンシングの第1世代の方法です。さらに、サンガーシーケンシングの基本はジデオキシチェーンターミネーション法です。

サンガーシーケンシング–手順

サンガーシーケンシングでは、DNAポリメラーゼは、in vitro DNA合成中に連鎖停止ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）を選択的に組み込む役割を果たします。したがって、ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）は、PCRによってアンプリコンに蛍光標識されます。ここでは、ddATPは緑色の色素で標識されています。 ddGTPは黄色の染料で標識されています。 ddCTPは青色で標識され、ddTTPは赤色色素で標識されています）次に、得られたアンプリコンをキャピラリー電気泳動で分離し、蛍光標識ヌクレオチドを検出します。

図1：サンガーシーケンシング法

サンガーシーケンシング–重要性

ただし、サンガーシーケンス法には、より長いシーケンス出力を処理できない、少数のサンプルの並列分析、サンプル準備を完全に自動化できない、コストが高い、シーケンスエラー、感度が低い（10〜20％）など、いくつかの制限があります。低レベルの変異対立遺伝子などの検出には不十分です。これらの制限にもかかわらず、多くの臨床手順におけるシーケンシングの「ゴールドスタンダード」です。

パイロシーケンスとは

パイロシーケンスは、従来のサンガーシーケンスの最初の代替手段です。これは、スウェーデン王立工科大学（KTH）で開発された次世代シーケンスの一種です。さらに、この方法は、プライマー指向のDNAポリメラーゼが触媒するヌクレオチドの取り込み中に放出されるピロリン酸（PPi）のルミノメトリー検出に基づいています。

パイロシーケンス–手順

一般に、この方法では、組み込まれたヌクレオチドを正確に検出するために4つの酵素が使用されます。それらは、DNAポリメラーゼ、ATPスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、およびアピラーゼです。さらに、シーケンシングプライマーは一本鎖DNAビオチン標識テンプレートにハイブリダイズします。さらに、4つのデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）、アデノシン5 'ホスホ硫酸（APS）、およびルシフェリンが反応混合物の基質です。

図2：パイロシーケンス法

重合カスケードが始まると、ポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みの結果として無機PPiが放出されます。ただし、放出されたPPiの量は、各サイクルで組み込まれたヌクレオチドの量と等モルです。続いて、ATPスルフリラーゼはAPSの存在下で放出されたPPiをATPに定量的に変換します。生成されたATPは、ルシフェラーゼ酵素によって媒介されるルシフェリンからオキシルシフェリンへの変換を促進します。また、この反応はATPの量に比例して可視光を生成します。そして、この光は560nmの波長で検出することができます。

パイロシーケンス–重要性

サンガーシーケンシングとパイロシーケンシングの類似点

サンガーシーケンシングとパイロシーケンシングの違い

意味

サンガーシーケンシングとは、鎖末端ジデオキシヌクレオチドを選択的に組み込むことによるDNAシーケンシングの方法を指し、パイロシーケンシングとは、合成によるシーケンシングの原理に基づくDNAシーケンシングの方法を指します。

シーケンスのタイプ

サンガーシーケンシングは第1世代のシーケンシングアプローチであり、パイロシーケンシングは第2世代のシーケンシングアプローチである次世代のシーケンシングケミストリーです。

相関

発明

フレデリックサンガーとその同僚は1977年にサンガーシーケンスを最初に開発し、ポールニレンと彼の学生であるモスタファロナギは1996年にストックホルムの王立工科大学でパイロシーケンスを最初に開発しました。

商業化

サンガーシーケンシングはAppliedBiosystemsによって最初に商品化されましたが、パイロシーケンシングはRoche454およびGSFLXTitaniumプラットフォームで使用されています。

原理

とりわけ、サンガーシーケンシングとパイロシーケンシングの主な違いは、サンガーシーケンシングはジデオキシチェーンターミネーション法を使用するのに対し、パイロシーケンシングは合成によるシーケンシングの原理に基づいていることです。

ヌクレオチドの同定

サンガーシーケンシングでは、ヌクレオチドの識別はDNAフラグメント全体の増幅後のキャピラリー電気泳動によって行われますが、パイロシーケンスでは、ヌクレオチドの識別は合成中にピロリン酸を放出して行われます。

検出

さらに、サンガーシーケンシングには蛍光灯の検出が含まれ、パイロシーケンシングには560nmの可視光の検出が含まれます。

DNAフラグメントの長さ

さらに、サンガーシーケンシングは最大800〜1000塩基対を読み取ることができ、パイロシーケンスは最大300〜500塩基対を読み取ることができます。

意義

サンガーシーケンシングは多くのステップを伴う複雑なプロセスですが、パイロシーケンシングはより少ないステップを伴うそれほど複雑でないプロセスです。

感度

また、サンガーシーケンシングとパイロシーケンシングのもう1つの違いは、サンガーシーケンシングの感度が低く、パイロシーケンシングの感度が高いことです。

結論

サンガーシーケンシングは、従来のシーケンシング方法である第1世代のシーケンシングアプローチです。また、これは多くのターゲットの「ゴールドスタンダード」です。ただし、ジデオキシチェーンターミネーション法とそれに続くキャピラリー電気泳動を使用します。一方、パイロシーケンスはサンガーシーケンスの最初の代替手段であり、次世代シーケンスの一種です。さらに、感度が高く、カバーするステップが少なくなります。一般的には、DNA断片の合成時にヌクレオチドをそのまま決定する合成シーケンシング法を採用しています。したがって、サンガーシーケンシングとパイロシーケンシングの主な違いは、シーケンシングの方法とその利点です。

参照：

1. Fakruddin、Md、およびAbhijitChowdhury。「パイロシーケンス-従来のサンガーシーケンスの代替手段。」 American Journal of Biochemistry and Biotechnology、vol。 8、いいえ。 1、2012、pp。14–20。、doi：10.3844 /ajbbsp.2012.14.20。

画像提供：

1. Estevezjによる「サンガーシーケンシング」– Commons Wikimediaによる自作（CC BY-SA 3.0）2。「JacopoPompilii、DensityDesignResearchLab」による「パイロシーケンシングの仕組み」。 – Commons Wikimediaによる自作（CC BY-SA 4.0）