イムノブロットとウエスタンブロットの違いに関して、イムノブロットはウエスタンブロットのより正確な名前です。これは、サンプルに存在する特定のタンパク質を検出するための分子生物学および免疫遺伝学の手法です。抗体はウエスタンブロットの過程に関与するため、より正確にはイムノブロットと名付けることができます。したがって、 原理、方法論、または用途において、イムノブロットとウエスタンブロットの間に有意差はありません。

基本的に、ウエスタンブロットでは、タンパク質はゲル電気泳動による変性とサイズ分離を受けます。続いて、分離されたタンパク質バンドは、ブロッティングとして知られるプロセスで、ニトロセルロースやPVDFなどのキャリアメンブレンに転写されます。最終的に、蛍光、放射性標識またはレポーター酵素と結合した抗体は、膜上の特定のタンパク質の認識に関与します。

対象となる主要分野

1. イムノブロットとは –簡単な説明2。 イムノブロットの方法論は何ですか –タンパク質の均等なローディング、タンパク質の分離、電気泳動移動、抗体プロービング3。 イムノブロットの用途は何ですか –生化学、臨床応用4。 ウエスタンブロットとは - 簡単な説明

重要な用語

タンパク質、イムノブロット、一次抗体、二次抗体、ウエスタンブロットの検出

イムノブロットとは

イムノブロットは、サンプル中の特定のタンパク質を検出するために、分子生物学および免疫遺伝学で最も頻繁に使用される手法です。一般に、この手法は、タンパク質の検出にアンチを使用するため、より具体的に「イムノブロット」と呼ばれます。

図1：イムノブロット

イムノブロットの方法論

タンパク質の均等な負荷

通常、イムノブロットの各サンプルあたりのタンパク質濃度を等しくすることが重要です。基本的に、各サンプルの3つの成分は、タンパク質抽出物、細胞溶解バッファー、およびサンプルバッファーです。ここで、細胞溶解緩衝液は、タンパク質抽出物を所望のタンパク質濃度に正規化するために重要です。さらに、サンプルバッファーまたはLaemmliバッファーは、イムノブロットサンプル調製に固有のものです。 SDS-PAGEで機能する試薬が含まれています。また、Tris-HCl pH 6.80グリセロール、SDS、ベータメルカプトエタノール、およびブロモフェノールブルーが含まれています。

Tris-HCl pH 6.80は、不連続バッファーシステムと組み合わせて機能します。また、グリセロールはロード中にサンプルに密度を追加します。これらに加えて、SDSは強力なイオン性界面活性剤であり、変性タンパク質を等しい陰イオン対質量比でコーティングします。したがって、これはタンパク質の電荷、サイズ、および形状をマスクし、分子量の関数としてタンパク質の分離を可能にします。一方、ベータメルカプトエタノールは、タンパク質の形状をある程度保持するジスルフィド結合を還元します。さらに、ブロモフェノールブルーはゲル電気泳動中の色素フロントとして機能します。

分子量によるタンパク質の分離

上記に続いて、SDS-PAGEは、界面活性剤と不連続バッファーシステムの助けを借りて、分子量によるサンプルの分離を可能にします。一般に、サンプルはゲルにロードする前に熱変性され、モノマー分子量によって確実に分離されます。また、SDS-PAGEの洗剤はSDSです。

図2：SDS-PAGE

電気泳動移動

通常、ブロッティングの複数の方法は、異なる膜へのタンパク質の電気泳動転写を伴います。ただし、それらの原理は類似しており、負に帯電したサンプルがアノードに向かって移動します。

図3：電気泳動転写

このプロセスでは、PVDF膜が登場するまで、ニトロセルロースが膜としてのゴールドスタンダードでした。重要なことに、これらの膜は前者に比べてより高いタンパク質結合能力を持っています。

抗体プロービング

最終的に、2種類の抗体がプロービングと分析に参加します。それらは一次および二次抗体です。今、タンパク質は膜上にあります。したがって、一次抗体は膜上のタンパク質の特定の領域に直接結合します。一方、二次抗体は一次抗体によって特定のタンパク質に間接的に結合します。重要なのは、ブロッキングは、抗体プロービングの前にメンブレンの残りの表面積をコーティングする手順です。したがって、これによりバックグラウンドが減少し、誤検知が排除されます。また、ブロッキングバッファーにはカゼインまたはウシ血清アルブミン（BSA）が含まれています。すべてサンプルタンパク質に対する親和性は低いです。さらに、2種類の抗体のそれぞれとメンブレンをインキュベートした後の洗浄ステップもバッ​​クグラウンドの低減に重要です。

図4：抗体プロービング

図5：化学発光検出

最後に、メンブレン上のバンドの視覚化により、使用した一次抗体に対する特定のタンパク質の存在が確認されます。

アプリケーション

通常、生化学では、イムノブロットは単一タンパク質またはタンパク質修飾の定性的検出にとって非常に重要です。また、バンドのサイズと色の濃さは、半定性的な分析を提供します。したがって、イムノブロットは、クローニング後のタンパク質生産の検証において重要です。

臨床的には、イムノブロットは血清および尿中の抗HIV抗体の検出において重要な役割を果たします。通常、ELISAテストの後にHIV診断を確認することが重要です。これにより、偽陽性が生じる可能性があります。また、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症または狂牛病、ライム病などの検出にも重要です。

ウエスタンブロットとは

「ウエスタンブロット」は、サンプル中の特定のタンパク質を検出するイムノブロットの別名です。ただし、「ウエスタンブロット」という用語は、DNAのサザンブロットの名を冠した後、1981年にW.ニールバーネットによって造られました。一方、サザンブロットは、メンブレンブロットで特定のDNA配列を検出するために、英国の生物学者エドウィンサザンによって開発されました。また、「ノーザンブロット」は、1977年にスタンフォード大学のJames Alwine、David Kemp、George Starkが、GerhardHeinrichの貢献により開発したRNA検出技術です。

イムノブロットとウエスタンブロットの違い

結論

イムノブロットは、抗体を使用してサンプル中の特定のタンパク質を検出する分子生物学の手法です。したがって、検出目的で抗体を使用するため、この手法のより正確な名前はイムノブロットです。ただし、反対の手法であるサザンブロットを表すために、「ウエスタンブロット」とも呼ばれ、ブロット内の特定のDNA配列を検出します。このプロセスに関して、イムノブロットでは、ゲル上で変性タンパク質をサイズ分離した後、得られたフラグメントをメンブレンに転写します。最後に、標識された抗体は膜上の特定のタンパク質に結合します。したがって、この説明に基づくと、原理、方法論、または用途に関して、イムノブロットとウエスタンブロットの間に有意差はありません。

参照：

1. Gavini K、Parameshwaran K.ウエスタンブロット（タンパク質イムノブロット）[2019年6月7日更新]。で：StatPearls [インターネット]。トレジャーアイランド（FL）：StatPearls Publishing; 2019年1月-。こちらから入手できます。

画像提供：

1. TimVickersによる「抗リポ酸免疫ブロット」– Commons Wikimediaによる自作（CC BY-SA 3.0）2。Commons Wikimediaによる英語版ウィキペディア（CC BY 3.0）のBensaccountによる「SDS-PAGE電気泳動」3.「ウエスタンブロット転送」英語版ウィキペディア（CC BY 3.0）のBensaccountによるCommons Wikimedia4。「ウエスタンブロットバインディング」英語版ウィキペディアのBensaccount（CC BY 3.0）によるCommons Wikimedia5。「ウエスタンブロット化学発光検出」 3.0まで）コモンズウィキメディア経由