全RNAからmRNAを分離する方法

オリゴdT /キャリアの組み合わせは、主にアフィニティークロマトグラフィーとして知られる技術によるトータルRNAからのmRNAの精製に使用されます。細胞の種類に基づいてトータルRNAからmRNAを分離する主な方法は2つあります。すなわち、mRNA分離の直接法とmRNA分離のマイナス法。この記事では、両方の方法について説明します。

メッセンジャーRNA（mRNA）は転写産物であり、一連のRNAヌクレオチドで構成されています。それはタンパク質の合成のために核から細胞質まで遺伝子の情報を運びます。特定の細胞株からRNAを分離すると、rRNAとtRNA、およびmRNAからなるトータルRNAが得られます。したがって、細胞株のトランスクリプトームの研究中に、mRNAをトータルRNAの混合物から分離する必要があります。分離には、mRNA分子の3 '末端にポリ（A）テールが存在するなど、mRNAの独自の特性が使用されます。オリゴdT分子はポリ（A）テールに相補的であるため、mRNAはトータルRNAの混合物から分離できます。

対象となる主要分野

1.mRNAとは –定義、構造、機能 2.トータルRNAの組成は？ – mRNA、rRNA、tRNA 3.トータルRNAからmRNAを分離する方法 –オリゴdT /キャリア分子の使用

重要な用語：アフィニティークロマトグラフィー、メッセンジャーRNA（mRNA）、マイナス法、オリゴdT、ポリ（A）テール、トータルRNA

mRNAとは

mRNAはタンパク質をコードする遺伝子の転写産物です。真核生物の核内で産生され、特定のタンパク質の産生に関する情報を細胞質に運びます。それは、リボソームの助けを借りて、翻訳中にタンパク質のアミノ酸配列に翻訳されます。真核生物の転写によって生成される一次転写産物は、プレmRNAと呼ばれます。

図1：mRNA構造

転写後修飾中に、5 'キャップやポリ（A）テールなどのいくつかの機能を備えた成熟mRNA分子が生成されます。特定の生物の総mRNAはそのトランスクリプトームとして知られています。

全RNAの組成は何ですか

RNA分離の結果はトータルRNAと呼ばれます。これは、細胞によって生成される3つの主要なタイプのRNAすべてで構成されています。それらは、mRNA、tRNA、およびrRNAです。 tRNAとrRNAの両方が翻訳を助けます。真核生物のmRNAのサイズは0.5〜20kbです。トランスファーRNA（tRNA）は、翻訳中に対応するアミノ酸をもたらします。それは76-90塩基対の長さであり、mRNA上の特定のコドンに相補的なアンチコドン領域で構成されています。リボソームRNA（rRNA）はリボソームの成分です。一部のヒトrRNAは5kbの長さです。

全RNAの90％以上がtRNAとrRNAで構成されています。全RNAの1-5％だけがmRNAです。典型的な哺乳動物細胞は、細胞あたり約500,000のmRNA分子で構成されている可能性があります。特定のタイプのmRNAの量は、細胞あたり15〜20、000コピーになる可能性があります。

全RNAからmRNAを分離する方法

cDNAライブラリーの構築、マイクロアレイ調製のためのサンプル調製、弱く発現する遺伝子のノーザンブロット分析などの多くの分子生物学技術には、高品質のmRNAが必要です。細胞のタイプに基づいてトータルRNAからmRNAを分離する主な方法は2つあります。mRNA分離の直接法とmRNA分離のマイナス法です。

mRNA分離の直接法

真核生物のトータルRNAから成熟mRNAを分離する原理には、ポリ（A）テールに相補的なオリゴdT（オリゴデオキシチミジル酸）を使用したポリアデニル化mRNAのアフィニティー選択/アフィニティークロマトグラフィーが含まれます。これは、他の2つのタイプのRNA（tRNAとrRNA）にポリ（A）テールがないことで可能になります。

mRNAは、ポリ（A）テールの30〜200個のアデニンヌクレオチドで構成されています。オリゴdT /キャリアの組み合わせで満たされたアフィニティーカラムは、トータルRNAからのmRNAの分離に使用されます。オリゴdT /キャリアの組み合わせは、セルロース結合オリゴdT、ストレプトアビジン結合磁気ビーズを含むビオチン化オリゴdT、またはオリゴdT結合ポリスチレンラテックスビーズのいずれかです。 RNAの酵素分解を防ぐために、すべての実験条件はRNaseフリー条件にする必要があります。

図2：アフィニティークロマトグラフィー

RNAの二次構造を破壊するために、トータルRNAを高塩濃度バッファーに溶解し、65〜70°Cに短時間加熱する必要があります。 RNAの分離条件は、mRNA分離用の市販のキットによって異なります。ただし、poly（A）-RNAまたはmRNAの調製は3つのステップで構成されています。

キャリアに接続されたオリゴdT分子へのポリ（A）-RNAのハイブリダイゼーション
結合していないRNAの洗い流し
低ストリンジェンシー条件下でのオリゴdT /キャリアの組み合わせからのポリ（A）-RNAの溶出

mRNA分離のマイナス法

オリゴdTベースのmRNAの精製では、ポリ（A）テールまたは成熟した真核生物のmRNAのみが生成されます。したがって、マイナス法として知られる別の方法を、ポリ（A）テールを持たないmRNAの精製に使用することができます。この方法は、酵母および細菌のトータルRNAからmRNAを分離する際に使用できます。また、真核細胞からの成熟mRNAとともに未成熟タイプのmRNAの単離にも使用できます。これには、トータルRNAから大きなリボソームRNAを枯渇させることによるトランスクリプトームの濃縮が含まれます。 RiboMinus^TM ThermoFisher Scientificのトランスクリプトーム分離キットは、酵母および細菌のトータルRNAからmRNAを効率的に精製するために3つのステップを使用します。

全RNAとrRNA配列特異的5 'ビオチン標識オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション
ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズと一緒にrRNA / 5'-ビオチン標識プローブ複合体の除去
不純物の精製とmRNAの溶出。

結論

トータルRNAは、mRNA、rRNA、tRNAの3つの主要なタイプのRNAで構成されています。全RNAからのmRNAの精製は、特定の生物のトランスクリプトームの分析に不可欠です。精製方法はmRNAの種類に基づいています。ポリ（A）テールを含む真核生物のmRNAは、オリゴdTを用いたアフィニティークロマトグラフィーで分離できます。未成熟な真核生物のmRNAと酵母および細菌細胞からのmRNAは、トータルRNAから大きなrRNAを枯渇させることによって分離できます。