シーケンシングは、特定のDNAフラグメントのヌクレオチド配列の決定に関与するプロセスです。シーケンシング中に、DNAフラグメントはPCRによって蛍光標識ヌクレオチドで最終的に標識されます。このプロセスでは、4種類の蛍光標識ヌクレオチドを使用します。これらはジデオキシヌクレオチド（ddNTP）です。 ddNTPは、入ってくるヌクレオチドのリン酸基が結合している3'OH基を欠いています。したがって、ddNTPが成長中の鎖に追加されると、鎖の3 '末端にヌクレオチドが追加されることはありません。つまり、成長中のチェーンにddNTPを追加すると、チェーンの成長が終了します。 ddNTPは低濃度でPCR混合物に添加されるため、各成長鎖は異なるレベルで終了します。発光する蛍光を検出して、PCRの最後にDNAフラグメントのヌクレオチド配列を決定します。

対象となる主要分野

1.DNAシーケンシングとは –定義、タイプ 2.DNAシーケンシングはどのように機能しますか –DNAシーケンシングのプロセス

重要な用語：ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）、蛍光マーカー、ゲル電気泳動、次世代シーケンシング、ヌクレオチドシーケンス、PCR、サンガーシーケンシング

DNAシーケンシングとは

DNAシーケンシングは、特定のDNA分子のヌクレオチド配列の決定に使用される実験技術です。 PCR中に組み込まれる蛍光標識ヌクレオチドを使用します。蛍光の検出に使用される技術に基づくシーケンシングには、サンガーシーケンシングと次世代シーケンシングの2つの主要な方法があります。

サンガーシーケンシング

1975年にFredricSangerによって開発されたサンガーシーケンスは、最初に開発されたシーケンス方法です。としても知られています 以来のチェーン終了方法 これは、in vitroDNA合成中に連鎖停止ddNTPの選択的取り込みに関与します。サンガーシーケンシングでは、アンプリコンはゲル電気泳動によって分離されます。サンガーシーケンシングは、クローニングに使用されるDNAフラグメントおよびPCRによって増幅されたフラグメントの配列を決定するために広く使用されています。決定されたDNA配列を図1に示します。

図1：DNAシーケンシング

次世代シーケンス

最新のDNAシーケンシングテクノロジーは、まとめて次世代シーケンシングとして知られています。チェーンターミネーション方式でもあります。次世代シーケンシングでは、キャピラリー電気泳動を使用して、チェーンターミネーション法で作成されたさまざまな長さのアンプリコンを分離します。次世代シーケンシングは、ゲノムシーケンシングなどの実行ごとの多数のヌクレオチドの決定に使用されます。

DNAシーケンシングはどのように機能しますか

DNAシーケンス中に、蛍光標識ヌクレオチドがPCRによって特定のDNAフラグメントに追加されます。 DNA鎖の伸長には、通常のデオキシヌクレオチド（dNTP）が使用されます。ただし、ddNTPは、蛍光標識された反応混合物に添加されます。 ddNTPはデオキシリボース糖分子に3'OH基を持たないため、それ以上の連鎖成長が起こらず、連鎖成長が停止する可能性があります。 DNAの糖リン酸骨格は、デオキシリボース糖の3'OH基と入ってくるヌクレオチドのリン酸基との間のホスホジエステル結合の形成によって形成されます。ただし、ddNTPは低濃度で追加されます。したがって、それらは連鎖成長を一度に終わらせることはありません。

4種類のddNTPが4つの別々のPCR混合物に追加されます。 ddATP、ddGTP、ddCTP、およびddTTPを追加することにより、4つの別々のPCR反応が実行されます。したがって、各反応混合物では、連鎖成長はそれぞれA、G、C、およびTヌクレオチドで終了します。一例として、ddATPを添加した反応混合物では、異なるアンプリコンの成長はDNAフラグメントの各Aヌクレオチドで終了します。サンガーシーケンシングによるDNA配列の決定を図2に示します。

図2：サンガーシーケンス

4種類のヌクレオチドはそれぞれ、個別の蛍光色でラベル付けされています。 NS ddATPは緑色の色素で標識されています。 NS ddGTPは黄色の染料で標識されています。 NS ddCTPは青でラベル付けされています。 NS ddTTPは赤い染料でラベル付けされています。したがって、4つのPCR反応のアンプリコンは別々の色でラベル付けされています。

目的のDNA断片を増幅した後、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動のいずれかによってアンプリコンを分離します。 DNA断片のヌクレオチド配列は、発光する蛍光を検出することで決定できます。 750〜100塩基対の長さのフラグメントのヌクレオチド配列は、サンガーシーケンシングによって実行ごとに簡単に決定できます。しかし、ゲノム内のヌクレオチドの数が多いため、全ゲノムのヌクレオチド配列の決定は依然として困難です。ただし、454シーケンスなどの次世代シーケンス技術では、1回の実行で約2,000万塩基対を読み取ることができます。

結論

DNAシーケンシングは、DNAフラグメントのヌクレオチド配列の決定に使用される分子生物学の手法です。シーケンシング中に、蛍光標識ヌクレオチドがPCRによってDNAフラグメントに追加されます。発光する蛍光を検出することにより、ヌクレオチド配列を決定することができます。

リファレンス：

1.「DNAシーケンシング」。カーンアカデミー、こちらから入手できます。

画像提供：

1.コモンズウィキメディア経由のSjefによる「DNAシーケンス」–自身の作品、パブリックドメイン）2。クリストフゲーマンズによる「ディデソキシメソッド」（modifiziert）–ノーマンモーダー博士、auf Basis einer Datei von Christoph Goemans（CC BY-SA 3.0 ）コモンズウィキメディア経由