蛍光マーカーはヌクレオチド配列の決定にどのように役立ちますか

DNAシーケンスは、特定のDNA分子のヌクレオチド配列を決定するのに役立つ手法です。シーケンスの2つの方法は、サンガーシーケンスと次世代シーケンスです。どちらのタイプのシーケンス方法も、最新の状態で完全に自動化されています。 DNA鎖はすべて、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、およびチミン（T）の4つのヌクレオチドで構成されています。 DNAフラグメントのヌクレオチドは、両方のタイプのシーケンス方法で4つの別々の蛍光マーカーでラベル付けされています。 蛍光マーカーまたはフルオロフォアは、光を吸収し、明確に定義された波長で発光させることができる分子です。蛍光マーカーは、PCRによってDNA鎖に組み込まれます。次に、ヌクレオチドの配列が自動化された技術によって決定されます。

対象となる主要分野

1.シーケンスとは –定義、サンガーシーケンス、次世代シーケンス 2.蛍光マーカーはヌクレオチド配列の決定にどのように役立ちますか –シーケンス手順

重要な用語：ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）、蛍光マーカー、ゲル電気泳動、次世代シーケンシング、ヌクレオチドシーケンス、PCR、サンガーシーケンシング

シーケンシングとは

シーケンシングは、DNA分子のヌクレオチド配列を決定するために使用される実験技術です。 DNAシーケンシング法の2つの主要なタイプは、サンガーシーケンシングと次世代シーケンシングとして識別できます。サンガーシーケンシングと次世代シーケンシングはどちらも、ヌクレオチド配列の決定に蛍光を伴う標識ヌクレオチドを使用します。

サンガーシーケンシング

サンガーシーケンシングは、DNAシーケンシングの最初に開発された方法です。シーケンシングの方法は、1975年にFredric Sangerによって最初に開発されました。そのため、サンガーシーケンシングとして知られています。サンガーシーケンシングの方法は、 チェーンターミネーション方式 これは、in vitroDNA合成中にDNAポリメラーゼによる鎖末端ジデオキシヌクレオチド（ddNTPS）の選択的取り込みに関与しているためです。 DNA鎖の伸長は、通常のデオキシヌクレオチド（dNTP）によって達成されます。ただし、連鎖成長を停止するために、ddNTPが反応混合物に追加されます。これらのddNTPは蛍光標識されています。 4種類のddNTPが4つの別々のPCR混合物に追加されます。したがって、ddATP、ddGTP、ddCTP、およびddTTPを追加することにより、4つの別々のPCR反応が実行されます。各反応混合物において、連鎖成長は、それぞれ、各Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴヌクレオチドで終了する。一例として、ddATPを添加した反応混合物では、異なるアンプリコンの成長はDNAフラグメントの各Aヌクレオチドで終了します。次に、これらの4つの反応をゲル電気泳動で分離し、蛍光光度計を使用して別々の蛍光をスキャンします。サンガーシーケンシングは、DNAクローニングで使用されるフラグメントおよびPCRによって増幅されたフラグメントの配列を決定するために広く使用されています。決定されたヌクレオチド配列を図1に示します。

図1：DNA配列

次世代シーケンス

最新のDNAシーケンシングテクノロジーは、まとめて次世代シーケンシングとして知られています。シーケンシング反応は、チップ上で一度にマイクロスケールで実行されます。したがって、いくつかのシーケンス反応が並行して実行されます。次世代シーケンシングでは、ゲル電気泳動に加えてキャピラリー電気泳動を使用して、チェーンターミネーション法で作成されたさまざまな長さのアムリコンを分離します。キャピラリー電気泳動は、分子を電気泳動移動度に基づいて分離する分析分離法です。

蛍光灯メーカーはヌクレオチド配列の決定にどのように役立ちますか

シーケンシング中、シーケンシングされるDNAは、PCRによるDNA合成のテンプレート鎖として機能します。 DNAプライマーは、DNAポリメラーゼによるDNA合成の開始に使用されます。通常の4つの塩基（dNTP; dATP、dGTP、dCTP、dTTP）と4つのジデオキシヌクレオチド（ddNTP; ddATP、ddGTP、ddCTP、およびddTTP）の1つの低レベルの混合物がPCR反応の成分として追加されます。したがって、4つのddNTPのそれぞれを追加することにより、4つの個別のPCR反応が実行されます。ジデオキシヌクレオチドには2つの特別な特徴があります。

それらは、入ってくるヌクレオチドがDNAポリメラーゼによって追加される3'-OH基を欠いています。したがって、ddNTPを組み込むと、連鎖成長が終了します。
それらは異なる蛍光色素で標識されています： ddATPは緑色の色素で標識されています、 NS ddGTPは黄色の染料で標識されています、 NS ddCTPは青でラベル付けされています、そしてその ddTTPは赤い染料でラベル付けされています.

ただし、チェーン終端ddNTPは低濃度で追加されます。 PCRプロセス全体を一度に終了するわけではありません。しかし、4つのddNTPの1つが成長中のチェーンに組み込まれると、その特定のチェーンの成長は終了します。したがって、 4つのPCR反応のそれぞれの終わりに、一連のアンプリコン（PCRによって得られたDNAフラグメント）が生成され、ターゲットDNAフラグメントの各ヌクレオチドで終了します。これらのアンプリコンはゲルで実行できます。電気泳動ゲルの定義されたポイントを通過する蛍光色素は、自動DNAシーケンサーのヌクレオチド配列を決定するために蛍光光度計でスキャンできます。 DNAシーケンシングで得られた蛍光標識ヌクレオチド配列を図2に示します。

図2：蛍光標識ヌクレオチド配列

一連のヌクレオチドのそれぞれを組み合わせることにより、最初のDNAフラグメントのヌクレオチド配列を決定することができます。 750〜1,000塩基対のフラグメントのヌクレオチド配列は、サンガーシーケンシングによって実行ごとに簡単に決定できます。ただし、ヌクレオチドが多数存在するため、ゲノム全体のシーケンスは依然として困難です。 454シーケンスは、1回の実行で2,000万塩基対を読み取ることができる次世代シーケンスの一種です。

結論

シーケンシングは、特定のDNAフラグメントのヌクレオチド配列の決定に使用される手法です。サンガーシーケンシングと次世代シーケンシングは、2つの主要なシーケンシングテクノロジーです。どちらの技術も、ヌクレオチド配列の決定に蛍光マーカーを使用しています。 4つの鎖末端ジデオキシヌクレオチドのそれぞれは4つの異なる蛍光色素で標識されており、それらは4つの別々のPCR反応で使用されて配列を取得します。

リファレンス：

1. Adams、JillU。「DNAシーケンシングテクノロジー」。 Nature News、Nature Publishing Group、こちらから入手できます。 2. Carr、Steven M.蛍光シーケンシング、こちらから入手できます。 3.「DNAの配列決定–蛍光色素による自動配列決定」。 JRankの記事、こちらから入手できます。