ウエスタンブロッティングはどのように機能しますか

ウエスタンブロッティングは、サンプル内の特定のタンパク質の検出に使用される分子生物学の手法です。 SDS-PAGEを使用してサイズに基づいてタンパク質を分離し、これらの分離されたタンパク質を膜に転写します。この手法では、ブロット内の特定のタンパク質の標識に特定の一次抗体を使用します。レポータータンパク質で標識された二次抗体は、一次抗体でラベル付けされたタンパク質を検出します。

対象となる主要分野

1.ウエスタンブロッティングとは –定義、事実、アプリケーション 2.ウエスタンブロッティングはどのように機能しますか –ウエスタンブロッティングのプロセス

重要な用語：発色、ニトロセルロースメンブレン、一次抗体、二次抗体、ウエスタンブロッティング

ウエスタンブロッティングとは

ウエスタンブロッティングは、サンプル内の特定のタンパク質の検出に使用されるハイブリダイゼーション技術です。この手法では、目的のタンパク質の標識と抗体標識タンパク質の検出の両方に抗体を使用するため、イムノブロッティングとも呼ばれます。

図1：ウエスタンブロット

ウエスタンブロッティングは1979年にTowbinによって最初に開発され、現在はタンパク質分析の日常的な手法として使用されています。

ウエスタンブロッティングはどのように機能しますか

ウエスタンブロッティングは、主にサンプル中の特定のタンパク質の検出に使用されます。ウエスタンブロッティング技術のステップを以下に説明します。

SDS-PAGE –タンパク質サンプルは、SDS-PAGEによってサイズに基づいて分離されます。
タンパク質を膜に転写する –サイズ分画されたタンパク質は、ニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレンに転写されます。この転送に含まれる手法は、拡散転送です。
非特定サイトのブロック –タンパク質の非特異的結合を防ぐために、メンブレンの占有されていない部位がブロックされます。この目的には、脱脂粉乳またはウシ血清アルブミン（BSA）を使用できます。
一次抗体のインキュベーション –ブロックされたメンブレンを一次抗体溶液とインキュベートします。これらの一次抗体は、膜上の特定のタンパク質に結合します。
二次抗体のインキュベーション –メンブレンは一次抗体に結合する二次抗体とインキュベートされます。二次抗体はレポータータンパク質に結合しています。これらのレポータータンパク質は、ビオチン、アルカリホスファターゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼである可能性があります。
発色によるタンパク質検出 –結合酵素レポーターは基質と反応して、着色されたアルカリホスファターゼを生成し、BCIPを青色の生成物に変換し、西洋ワサビペルオキシダーゼはルミノールを変換して発光します。