PCR用のプライマーの作り方

プライマーは、invivoおよびinvitroの両方でDNAを増幅する上で不可欠な要素です。インビボでは、酵素であるDNAポリメラーゼは、DNA複製を開始するためのプライマーを必要とします。インビトロでは、プライマーは主にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の開始に使用されます。シーケンシング、クローニング、部位特異的変異誘発などを含む他のいくつかの技術には、プライマーが必要です。したがって、in vitro技術用のプライマーの設計は非常に簡単になりますが、分子生物学者にとっては困難なプロセスです。したがって、この記事では、PCRとシーケンシングの両方のプライマー設計の基本的なルールについて説明します。

対象となる主要分野

1.入門書とは –定義、タイプ、役割 2.プライマーはPCRでどのように機能しますか – DNAの特徴、PCRのプロセス 3.PCR用のプライマーの作り方 –PCRプライマーを設計するための基本的なルール 4.シーケンシングプライマーの設計方法 –シーケンシングプライマーの機能

重要な用語：DNA合成、フォワードプライマー、長さ、融解温度、PCR、リバースプライマー、シーケンシングプライマー

入門書とは

プライマーは、DNA合成の開始点として機能するDNAまたはRNAの短い鎖です。 DNA複製を触媒する酵素は、既存の3 '末端にヌクレオチドを付加することができます。したがって、プライマーはプライムとして機能することにより、DNA合成の基礎を築きます。 RNAプライマー DNAポリメラーゼによるDNA複製の開始のために細胞内で使用されます。ただし、合成 DNAプライマー 主にPCRやその他の技術によるDNAの増幅に使用できます。 PCRには2種類のプライマーが使用され、フォワードプライマーとリバースプライマーとして知られています。 PCR中に、フォワードおよびリバースプライマーによってゲノムDNA内の特定のDNA配列に隣接することにより、目的のDNAフラグメントの何百万ものコピーを作成できます。特定のDNA配列に隣接するフォワードおよびリバースプライマーを図1に示します。

図1：フォワードおよびリバースプライマー

PCRでプライマーはどのように機能するか

DNAは、2本の鎖が一緒に保持されている分子です。塩基対パターンは、両方のストランドでそれぞれに相補的です。 2つのストランドは、相補的な窒素塩基間の水素結合によって結合されています。さらに、各ストランドには独自の方向性があります。一方のストランドは5 'から3'の方向性を持ち、もう一方のストランドは3 'から5'の方向性を持ちます。したがって、2つのストランドは逆平行です。 5 'から3'方向の鎖はセンス鎖として知られ、3 'から5'方向の鎖はアンチセンス鎖として知られています。 PCR中に各2本の鎖を個別に合成する必要があります。

PCRの3つのステップは、変性、アニーリング、および伸長です。変性では、95°Cに加熱して水素結合を切断することにより、DNAの2本の鎖を分離します。フォワードプライマーはセンス鎖に結合し、リバースプライマーはアンチセンス鎖に結合します。プライマーのアニーリングは、温度が95°Cから50-60°Cに下がったときに行われます。したがって、両方の鎖は、Taqポリメラーゼの助けを借りて同時に合成することができます。センス鎖とアンチセンス鎖の両方の増幅は、5 'から3'方向に起こります。 PCRは指数関数的な反応であるため、3つのステップが25〜35サイクルで繰り返されます。フォワードプライマーとリバースプライマーの両方が各サイクルで使用され、約2を生成します³⁵ 目的のDNAフラグメントのコピー。 PCRにおけるプライマーの役割を図2に示します。

図2：PCR

PCR用のプライマーの作り方

ゲノム内の特定のDNAフラグメントを増幅するには、その特定のDNAフラグメントにフォワードプライマーとリバースプライマーの両方が隣接している必要があります。したがって、両方のプライマーは、DNAフラグメントに隣接する配列に相補的である必要があります。 PCRプライマーの設計を成功させるための基本的なガイドラインを以下に説明します。

フォワードプライマーとリバースプライマーの両方の方向は5 'から3'でなければなりません。
各プライマーの長さは18から25ヌクレオチドの長さでなければなりません。
プライマーのGC含量は40〜60％であり、プライマーの3 '末端にCまたはGが存在すると、結合が促進される可能性があります。
プライマーペアの融解温度とTm（プライマーの半分がテンプレートにアニーリングする温度）は類似しており、60°Cを超えている必要があります。最大差は5°Cである必要があります。
プライマーの3 '末端はテンプレートDNAと正確に一致している必要があります。
プライマーの3 '末端の最後の5塩基には、少なくとも2GまたはC塩基（GCクランプ）が存在する必要があります。 GCクランプは、ターゲット配列への強力な結合を促進します。
プライマーの5 '末端に5〜6ヌクレオチドの制限部位を追加できます。
ジヌクレオチドリピート（ATATATAT）または同じヌクレオチドの4回を超えるリピート（ACCCC）は、プライマー配列では避ける必要があります。これにより、プライミングミスが発生します。
プライマー内の相同性またはプライマーの二次構造は避ける必要があります。フォワードおよびリバースプライマーのプライマー間相同性または相補配列は避ける必要があります。どちらの条件も、セルフダイマーまたはプライマーダイマーを形成する可能性があります。
二量体分析のΔG値は、0〜-9 kcal / moleである必要があります。

Primer 3、Primer X、NetPrimer、DNAstrarなどのプライマー設計を容易にするための多くのオンラインツールが利用可能です。設計されたプライマーの特異性は、NCBIPrimer-BLASTまたはUCSCin-silicoPCRなどのツールによって決定できます。。

図3：Primer3インターフェース

シーケンシングプライマーの設計方法

シーケンシングプライマーは、PCRプライマーと同じように、短いDNA鎖です。ただし、PCRプライマーは特定のDNAフラグメントを増幅するように設計されており、シーケンスプライマーはPCRによって増幅されたDNAフラグメントのヌクレオチド配列を明らかにするために使用されます。 PCRプライマーとは異なり、ターゲット配列の長さが500 bp未満の場合は、単一のプライマーをシーケンスに使用できます。一例として、PCRのフォワードプライマーをシーケンシングに使用して、センス鎖のみを増幅することができます。さらに、シーケンシング反応中に許容されるミスマッチの程度は、PCRよりも高くなります。一般的に、PCRプライマーは標的配列に相補的です。ただし、一部のシーケンシングプライマーはターゲット配列に関連していません。それらはユニバーサルプライマーとして知られています。 T7やSP6などのユニバーサルプライマーは、標的配列を運ぶベクターにアニーリングします。それらは、さまざまなベクターとさまざまなタイプのDNAフラグメントの両方に使用できます。

結論

プライマーは、DNA合成を開始するためのPCRおよびシーケンシングで使用されます。フォワードプライマーとリバースプライマーには、2種類のPCRプライマーがあります。フォワードプライマーはセンス鎖にアニーリングし、リバースプライマーはアンチセンス鎖にアニーリングします。シーケンシングでは、フォワードまたはリバースプライマーのいずれかを使用してターゲットを増幅できます。プライマーの設計時には、プライマーの長さ、Tm、GC含量などの多くの要素を考慮する必要があります。特定の配列のプライマーの設計に使用できる多くのオンラインツールが利用可能です。