安定したトランスフェクト細胞株の作り方

安定したトランスフェクションとは、外来DNAを細胞に長期間導入することです。安定的にトランスフェクトされた細胞は、外来DNAを子孫に通します。したがって、 安定的にトランスフェクトされた細胞株を作るには、外来DNAを細胞株のゲノムに組み込む必要があります。 ただし、安定した継承は非ゲノムDNAでも観察できます。トランスフェクションを成功させるには、効果的なDNA送達方法と、細胞株内の外来DNAの選択方法が必要です。安定的にトランスフェクトされた細胞株は、組換えタンパク質の生産、遺伝子機能研究、創薬アッセイなどの幅広いアプリケーションに使用されます。

対象となる主要分野

1.安定したトランスフェクト細胞株の作り方 –安定した細胞株生成プロトコル 2.細胞株でトランスフェクトされたDNAを選択する方法 –安定的にトランスフェクトされた細胞株の選択

重要な用語：エピソームの維持、ゲノムへの統合、プラスミド、選択、安定的にトランスフェクトされた細胞株

安定したトランスフェクト細胞株の作り方

トランスフェクションは、遺伝物質が化学的または非化学的方法によって宿主細胞に意図的に導入される遺伝子導入の方法です。安定的にトランスフェクトされた細胞株には2つのタイプがあります。

安定した細胞株の主なタイプは、トランスフェクトされたDNAが宿主生物のゲノムに直接組み込まれることによって生成されます。トランスフェクトされたDNAは、相同組換えによってゲノムに組み込まれます。
安定した細胞株を生成する他の方法は、トランスフェクトされたDNAのエピソーム維持です。真核生物のベクターは、ゲノムに組み込まれていないDNAのトランスフェクションに使用されます。ただし、エピソームDNAの安定性は低いです。また、エピソームは特定の種類の種によってのみ維持されます。安定的にトランスフェクトされた細胞株を図1に示します。

図1：安定的にトランスフェクトされた細胞株

プロセス

安定した細胞株の生成に関与するステップを以下に説明します。

最適な選択抗生物質濃度を決定する殺傷曲線の生成–細胞は、1週間にわたってすべての細胞を殺すのに必要な最小抗生物質濃度を決定するために、抗生物質濃度の量を増やします。
目的のプラスミドコンストラクトによる細胞のトランスフェクション–トランスフェクションの方法は宿主細胞の種類によって異なります。リポソーム試薬は、付着細胞株のトランスフェクションに使用されます。電気トランスフェクションまたはウイルス法は、浮遊細胞株をトランスフェクトするために使用されます。
安定したポリクローナルコロニーを選択して拡大–トランスフェクションの48〜72時間後に、高濃度、最適濃度、および低濃度の選択的抗生物質を培養物に添加して、安定的にトランスフェクトされた細胞株を取得します。

細胞株でトランスフェクトされたDNAを選択する方法

選択マーカーは、トランスフェクトされた細胞を選択するために、トランスフェクトされたDNAと共発現します。マーカー遺伝子は、宿主細胞のトランスフェクションに使用されるのと同じベクター（cis）または別のベクター（trans）にある可能性があります。ネオマイシン、ゼオシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、DHFRなどの抗生物質に対する耐性を選択に使用できます。さらに、トランスフェクトされた遺伝子はGFPでタグ付けすることができます。