部位特異的変異誘発のためのプライマーを設計する方法

部位特異的変異誘発（SDM）は、既知の配列に変異を作成するinvitroの方法です。多くの場合、PCRベースの方法で実行されます。通常、部位特異的変異誘発では1つまたは2つの塩基が変化します。プライマーは、ヌクレオチド配列に小さな変更を導入するために必要な変異を使用して設計できます。プライマー伸長とインバースPCRを使用して、大規模な変異を導入することができます。このアプローチは、特定のタンパク質のアミノ酸組成を変える可能性があります。部位特異的変異誘発は、タンパク質の活性の変化を研究するために使用されます。また、融合タンパク質の作成にも使用されます。

対象となる主要分野

1.部位特異的変異誘発（SDM）とは –定義、役割、方法 2.部位特異的変異誘発のためのプライマーを設計する方法 –置換、削除、挿入

重要な用語：削除、挿入、突然変異、部位特異的変異誘発、置換、従来のPCR

部位特異的変異誘発とは何ですか

部位特異的変異誘発は、遺伝子のヌクレオチド配列に特定の変化を導入するために使用される分子生物学の手法です。タンパク質のアミノ酸配列の変更、制限部位の導入または除去、転写結合部位の破壊、融合タンパク質の作成に使用されます。

プロセス

部位特異的変異誘発の間、変異は、所望の変異からなるプライマーを使用してプラスミドに導入される。テンプレート全体がPCRによって増幅され、変異がテンプレートに組み込まれます。次に、酵素であるメチル化依存性エンドヌクレアーゼを使用して、親テンプレートをサンプルから除去します。 PCR産物または目的の変異を持つニックの入ったプラスミド分子が細菌に形質転換されます。プラスミドは、所望の改変を加えて細菌から単離することができる。部位特異的変異誘発のプロセスを図1に示します。

図1：部位特異的変異誘発

部位特異的変異誘発において所望の変異を導入するために、3つの主要なタイプの方法が使用されます。それらは、従来のPCR、プライマー伸長、および逆PCRです。プライマー伸長とインバースPCRを使用して、大規模なヌクレオチド変化を導入できます。

従来のPCR

従来のPCRを使用して、修飾プライマーを使用してターゲット配列に1つまたは2つのヌクレオチド変化を導入できます。変更は、ヌクレオチドの置換、削除、または追加である可能性があります。変異はPCR中にアンプリコンに組み込まれます。したがって、元の配列は、プライマー内の変異した配列に置き換えられます。

プライマーエクステンション

プライマーエクステンションでは、ネステッドPCR中に目的の変異が組み込まれます。ここでは、ターゲット配列に2つのプライマーが隣接しています。目的の変異が内部プライマーに組み込まれ、2回目のPCRラウンドで変異が導入されます。一般に、PCR反応の特異性は、プライマー中のミスマッチヌクレオチドの数が増えると低下します。ただし、ネストされたPCRはPCR反応の特異性を高める可能性があるため、大規模な変異を持つ長い内部プライマーをプライマー伸長に使用できます。

インバースPCR

インバースPCRは、既知のDNA配列に対するプライマーを設計することにより、未知のDNAフラグメントを増幅する方法です。大規模なヌクレオチドの置換、削除、挿入に使用できます。

部位特異的変異誘発の応用を以下に説明します。

タンパク質の構造、機能、および触媒特性を研究するには
タンパク質の特性を向上させるため（タンパク質工学）
制限エンドヌクレアーゼ部位を導入または除去すること。

部位特異的変異誘発のためのプライマーを設計する方法

部位特異的変異誘発は、プライマーを使用して目的の変異を導入するプロセスです。突然変異は、置換、挿入、または削除である可能性があります。プライマー中のミスマッチヌクレオチドの増加に伴ってPCRの特異性が低下するため、従来のPCRではターゲット配列に1つまたは2つの塩基対の変化しか導入できません。プライマー伸長やインバースPCRなどの他の方法を使用して、大規模な変異を導入することができます。部位特異的変異誘発におけるプライマー設計を図2に示します。

図2：部位特異的変異誘発の入門書

置換

置換の場合、2つのプライマーの1つに、プライマーの中央に目的の変異が含まれている必要があります。ここで、変異を含む部位は、歪みを形成するため、標的配列にアニーリングしません。

消す

削除の場合、ターゲットから削除されるシーケンスは、プライマーの設計時に無視できます。この配列はプライマーによって隣接領域から離れて位置しているため、PCR中に増幅されることはありません。

挿入

挿入の場合、追加される配列は、プライマーの設計時にプライマーの1つの5 '末端に絡み合います。したがって、挿入されたシーケンスもアンプリコンにアタッチされたままになる可能性があります。

結論

部位特異的変異誘発は、DNA配列に変異を導入するために使用される技術です。これらの変異は、置換、挿入、または削除である可能性があります。従来のPCRでは小規模な変異を導入することができます。大規模な変異は、プライマー伸長またはインバースPCRで導入できます。変異の導入は、目的の変異をプライマーに組み込むことによって行われます。