QPCR用のプライマーを設計する方法
目次:
定量的またはリアルタイムPCRは、さまざまな実験条件下での遺伝子発現の相対的変化をモニタリングするためのルーチンアッセイとして使用されます。 QPCR中のプライマーとプローブの設計は、アッセイの品質と成功に影響を与える最も重要な要素の1つです。 QPCR用のプライマーの設計にはいくつかのガイドラインが適用されます。プライマーのGC含量は35〜65％である必要があります。プライマーの融解温度は60〜68°C以内である必要があります。二次構造、3塩基より長いGまたはCの繰り返し、およびプライマーダイマーの形成も避ける必要があります。
対象となる主要分野
1.QPCRとは –定義、プロセス、使用 2.QPCR用のプライマーを設計する方法 –QPCRのプライマー設計のガイドライン
重要な用語：蛍光色素、GC含量、融解温度、プライマー、定量PCR（QPCR）
QPCRとは
QPCRは、製品をリアルタイムで定量化できるPCRの一種です。蛍光色素は、各ステップで標識することにより、PCR産物の定量に使用できます。 QPCRアッセイでは、2つの蛍光標識法を使用できます。それらは、蛍光色素と蛍光標識プローブの使用です。蛍光色素はPCR産物に結合し、プローブはPCR産物とアニーリングして安定した三本鎖DNAを形成します。 QPCCRで広く使用されている蛍光色素はSYBRGreenですが、プローブはTaqmanにすることができます。 QPCR中のPCR産物の検出にプローブを使用すると、より正確な結果が得られ、アッセイの感度が向上します。
図1：QPCRのメカニズム
QPCR用のプライマーを設計する方法
QPCR用のプライマーの設計は、アッセイの信頼性、精度、および感度を高める上で非常に重要です。 QPCRプライマーの設計に関するガイドラインを以下に説明します。
- PCR産物/アンプリコンサイズ– PCR産物のサイズは50〜210塩基対である必要があります。
- プライマーの長さ–プライマーの長さは19〜23ヌクレオチドである必要があります。
- GC含量–プライマーのGC含量は35〜65％である必要があります。
- 融解温度（Tm）–プライマーの融解温度は60〜68°Cである必要があります。アッセイのアニーリング温度は、プライマーのTmより5°C低くなっています。
- エクソン-エクソンジャンクション– QPCRでcDNAを増幅する場合、汚染されたDNAの増幅を避けるために、プライマーはエクソン-エクソンジャンクションにまたがる必要があります。
- リピートとラン–ジヌクレオチドリピート（TCTCTCTCTC）とリピートヌクレオチド（例：TAAAAAAAGC）は避けてください。
- 3 '相補性–プライマーダイマーの形成を防ぐために、フォワードおよびリバースプライマーの3'末端の相補領域は避ける必要があります。
- 3 '安定性–アニーリングの安定性を高めるために、プライマーの3'末端にGまたはC残基を含める必要があります。
- GCクランプ–プライマーの5 '末端にある1つまたは2つのGCクランプにより、アニーリングの特異性が高まります。
- 特異性–プライマーの特異性はBLASTでチェックする必要があります
- SNP –プライマーには既知のSNP（一塩基多型）のバリエーションを含めないでください
Primer3、Primer-BLAST、IDT PrimerQuest、Primer Bank、OATなど、いくつかのオンラインツールをQPCRのプライマー設計に使用できます。
図2：プライマーダイマーの形成
プライマーは、QPCRでプライマーダイマーが形成されないように設計する必要があります。 PCR産物の検出に蛍光色素を使用する場合、これらの色素はプライマーダイマーとも結合して偽陽性の結果をもたらすため、非常に重要です。
結論
QPCRは、PCR産物の検出と定量化に使用されます。プライマーの設計は、結果の精度を高めるためにQPCRで重要です。したがって、QPCR用のプライマーを設計する際にはガイドラインに注意深く従うことが重要です。
リファレンス：
1.「QPCRアッセイの設計と最適化」。 LSR |バイオ・ラッド、こちらから入手できます。
画像提供：
1.ユーザーによる「Taqman」：Braindamaged– Commons Wikimedia2を介した元のアップローダー（パブリックドメイン）による自身の作品。 TzachiBarによる「PrimerdimersformationEn」– Commons Wikimediaによる自作（CC BY-SA 3.0）
