主な違い–PCRとRT-PCR

PCRとRT-PCRは、分子生物学における2つの重要な手法です。 PCRは、1980年代にKaryMullisによって開発されました。特定の遺伝子のコピー数を指数関数的に増加させることができ、その特定のDNAフラグメントの検出を容易にします。 Taqポリメラーゼは、PCRシステムで最も頻繁に使用される酵素です。耐熱性酵素です。 RT-PCRでは、逆転写の後にPCRが続きます。酵素である逆転写酵素は、RNAからの相補的DNAの合成に関与しています。 NS 主な違い PCRとRT-PCRの間は PCRは二本鎖DNAをテンプレートとして使用しますが、RT-PCRはRNAをテンプレートとして使用します。

対象となる主要分野

1.PCRとは –定義、プロセス、アプリケーション 2. RTPCRとは –定義、特性、アプリケーション 3.PCRとRTPCRの違いは何ですか –主な違いの比較

重要な用語：PCR、RT-PCR、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応、DNAテンプレート、DNAポリメラーゼ、変性、アニーリング、プライマー伸長

PCRとは

PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）は比較的単純ですが革新的な方法です。 PCRは、酵素であるDNAポリメラーゼの能力を使用して、提供されたテンプレート鎖に相補的な方法でDNAの新しい鎖を合成します。 PCRは、遺伝子の機能分析、遺伝性疾患の診断とモニタリング、DNAクローニング、配列決定、および古代DNA増幅のために、臨床検査室と研究室の両方で使用される不可欠な技術です。 DNAテンプレート、ヌクレオチド、プライマー、およびDNAポリメラーゼは、PCRの4つの主要なコンポーネントです。 NS DNAテンプレート 通常、増幅される標的配列を持つ二本鎖DNAです。 TaqDNAポリメラーゼ サーマス水生生物から分離されたものは、PCRで一般的に使用されます。 NS PfuDNAポリメラーゼ 忠実度の高い別のタイプのDNAポリメラーゼです。 TaqおよびPfuポリメラーゼはどちらも耐熱性があります。 DNAポリメラーゼによって追加されるヌクレオチドは、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、およびチミン（T）です。 DNAポリメラーゼは、既存のDNA鎖の3 '末端にのみ新しいヌクレオチドを追加できるため、DNA合成の開始にはオリゴヌクレオチドプライマーが必要です。 PCRでのプライマーの要件により、テンプレート内の特定の領域のみを描写できます。標的配列には、フォワードおよびリバースプライマーが隣接しています。 PCRの終わりに、特定のDNA配列のアンプリコンと呼ばれる新しいコピーが数十億単位で蓄積されます。 PCRのコンポーネントは、失敗を最小限に抑えながらPCRのパフォーマンスを向上させるように最適化する必要があります。

PCRは、異なる温度を切り替えることができるサーマルサイクラーによって行われる自動化されたプロセスです。 PCRは3段階のプロセスです。

1. 変性 –二本鎖DNAテンプレートは、94〜95°Cに加熱することで2本の一本鎖に分離されます。
2. アニーリング –フォワードおよびリバースプライマーは、テンプレート内の相補配列に結合します。このステップの温度は、プライマーの組み合わせの融解温度に依存します。
3. プライマー拡張 – DNAポリメラーゼ酵素は、成長する鎖に相補的な塩基を追加することにより、3 '末端で各プライマーを拡張します。 Taqポリメラーゼの最適温度である72°Cは、伸長ステップの温度として使用されます。伸長の時間は、テンプレート鎖の塩基対の数によって異なります。

3つのステップが28〜35回繰り返されます。

図1：ポリメラーゼ連鎖反応

PCRの産物は、DNAラダーと比較してアガロースゲル電気泳動によってサイズ分画されます。アガロースゲルでのDNAの可視化は、臭化エチジウムで染色し、UV下で観察することによって行われます。臭化エチジウム染色ゲルでUV下で増幅されたDNAバンドを図2に示します。DNAラダーは左端のウェルに示されています。

図2：DNAバンド

RT-PCRとは

RT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）は、mRNAの検出に使用される最も感度の高い手法の1つです。 RNAは、正常組織の遺伝子発現または感染組織の遺伝子発現に関する情報を収集するための適切なテンプレートです。 RT-PCRのテンプレートは、それぞれトータルRNAまたはウイルスまたはバクテリアRNAのいずれかです。 RNAは、酵素である逆転写酵素によって相補DNA（cDNA）に逆転写されます。逆転写酵素の最適温度は46°Cです。産物を得るために、cDNAはPCRで使用されます。逆転写PCRのステップを図3に示します。

図3：RT-PCR

RT-PCRは、2段階または1段階の反応で実行できます。 2段階反応では、逆転写とPCRが2つの別々の段階で実行されます。ワンステップRT-PCRでは、逆転写の後に1本のチューブで順次PCRを行います。サイズの分画と視覚化の目的で、cDNAと最終的なPCR産物の両方をアガロースゲルで泳動することができます。 1ステップおよび2ステップのRT-PCRを図4に示します。

図4：1ステップおよび2ステップのRT-PCR

PCRとRT-PCRの違い

意味

PCR： PCRは、分子生物学で使用される技術であり、DNAのセグメントを増幅して、DNA配列の数百万のコピーを生成します。

RT-PCR： RT-PCRは、分子生物学における遺伝子発現の検出に使用されるPCRの変種です。

ステップ

PCR： 変性、アニーリング、伸長はPCRの3つのステップです。

RT-PCR： RT-PCRでは、逆転写の後にPCRが続きます。

レンプレート

PCR： 二本鎖DNA分子はPCRのテンプレートとして機能します。

RT-PCR： 一本鎖RNA分子は逆転写のテンプレートとして機能します。一本鎖DNA分子はPCRのテンプレートとして機能します。

使用される酵素

PCR： DNAポリメラーゼはPCRの酵素として使用されます。

RT-PCR： 逆転写酵素とDNAポリメラーゼは、RT-PCRの酵素として使用されます。

プライマー

PCR： PCRではフォワードおよびリバースプライマーが使用されます。

RT-PCR： 逆転写にはリバースプライマーのみが使用され、PCRではフォワードプライマーとリバースプライマーの両方が使用されます。

感度

PCR： PCRは感度の高い方法です。

RT-PCR： RT-PCRはPCRよりも感度が高いです。

アプリケーション

PCR： PCRは、遺伝子の機能分析、遺伝性疾患の診断とモニタリング、DNAクローニング、DNA配列決定、および古代DNA増幅に使用されます。

RT-PCR： RT-PCRは遺伝子発現の検出に使用されます。

結論

PCRとRT-PCRは、分子生物学で使用される2つの重要な手法です。 PCRとRT-PCRはどちらも、フォワードプライマーとリバースプライマーによって定義されるターゲットDNA配列のコピー数を指数関数的に増加させることができる自動化された手法です。 PCRでは、二本鎖DNAがテンプレートとして使用されます。 PCRにより、遺伝子のDNAクローニング、DNA配列決定、および機能分析を行うことができます。 RT-PCRでは、RNAを増幅することで特定の組織での遺伝子発現を観察できます。 PCRとRT-PCRの主な違いは、各反応で使用されるテンプレートとそのアプリケーションにあります。

リファレンス：

1.「ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）」。国立バイオテクノロジー情報センター。米国国立医学図書館、n.d。ウェブ。こちらから入手できます。 2017年6月1日。2。「ポリメラーゼ連鎖反応（またはPCR）」。遺伝子のクローニングと分子分析。 N.p.、n.d。ウェブ。こちらから入手できます。 2017年6月1日。3。ニューイングランドのBiolabs。 「CDNA合成とRT-PCR」。 CDNA合成とRT-PCR | NEB。 N.p.、n.d。ウェブ。こちらから入手できます。 2017年6月1日。

画像提供：

1. Enzoklopによる「ポリメラーゼ連鎖反応」– Commons Wikimediaによる自身の研究（CC BY-SA 3.0）2。「DNAfragmendidetiidiumbromiidigavärvitudagaroosgeelis」。 Rainis Venta著– Commons Wikimedia 3による自作（CC BY-SA 3.0）「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」Jpark623による– Commons Wikimedia 4による自作（CC BY-SA 3.0）「ワンステップvsツーステップJpark623による「RT-PCR」– Commons Wikimediaによる自作（CC BY-SA 3.0）